肌原纤维蛋白（MP）是肉蛋白中最重要的组成部分，约占总蛋白质含量的55%～60%，其在热处理条件下会通过非共价相互作用和共价交联形成有序的三维网状的凝胶基质，赋予肉制品良好的保水、保油特性和感官特性。谷氨酰胺转氨酶（TGase）能够催化蛋白质多肽链中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基与赖氨酸残基的ε-氨基发生共价交联，产生ε-(γ-谷氨酰胺)赖氨酸键，增强蛋白分子内或分子间的共价交联。

  东北农业大学食品学院的张靖铭、冯旸旸、刘 骞*等详细的介绍了TGase催化MP-DCL测定和表征方法，通过一系列分析其影响因素揭示TGase改善MP凝胶品质的内在机制，并综述了外源添加物或新型加工技术协同TGase对MP凝胶特性的影响及分子作用机制，为后续TGase在现代肉制品工业中的应用提供理论参考。

  目前国内外对于表征TGase催化效果的DCL的测定方法如表1所示。ε-(γ-谷氨酰胺)赖氨酸键是TGase催化MP共价交联过程中形成的一种异肽键，其含量的多少直接表明了DCL的数量多少。同时，因为MP中的游离氨基参与异肽键形成，所以游离氨基含量的降低可间接反映ε-(γ-谷氨酰胺)赖氨酸键的增加，即DCL增加，可用下式表示。此外，大分子聚集物的形成或肌球蛋白重链（MHC）的减少也可以表示DCL的增加。

  TGase作为一种蛋白质交联酶，其催化MP共价交联的过程符合酶促反应动力学，因此DCL受内部因素和反应环境的制约，其中内部因素包括酶浓度、底物浓度和底物结构，反应环境包括温度、时间和离子强度（图2）。

  在酶促反应中，酶浓度和底物的浓度是限制反应速率的最重要的因素。研究之后发现，TGase添加量的增加使MP的G′值显著增大，其原因是当TGase添加量较低时，只有少部分MP分子能够产生交联，当TGase添加量充足时，MP分子之间才会充分交联。同时，杨明柳等研究之后发现SDS-PAGE图谱中MHC带随TGase添加量的增加逐渐减弱，同样说明了DCL随TGase添加量的增加而增加。但有必要注意一下的是，由于MP中的谷氨酰胺和赖氨酸残基含量有限，所以DCL并不是随着TGase添加量的增加而无限增加。

  氧化会改变MP结构，进而影响MP分子内及分子间的共价交联。Li Chunqiang等研究之后发现经TGase处理的轻度氧化MP的DCL为87.6%，未氧化MP的DCL为64.7%，而过度氧化MP的DCL仅为33.8%，说明轻度氧化有利于增加DCL，使MP形成更致密、均匀的三维网络凝胶结构。这原因是轻度氧化时，MP分子中有少量巯基转化为二硫键使蛋白质聚集，拉近了谷氨酰胺和赖氨酸残基的距离而促进TGase的催化反应。

  一方面，温度的变化会导致MP结构发生变化，研究表明肌球蛋白头部在30～50 ℃时开始聚集，50～60 ℃时形成较大的球状聚集体；另一方面，温度还会影响酶的活性，TGase作用的温度范围为4～65 ℃，最适温度为45～55 ℃。Shi Yafang等研究了TGase在30～90 ℃条件下作用20 min对DCL及MP凝胶特性的影响，根据结果得出，在40 ℃条件下，TGase的交联能力最强并对MP凝胶的质构特性具有最明显的提升效果。

  根据温度的不同，酶的作用时间也不相同，TGase催化常用的有4 ℃低温长时间交联和40 ℃短时间孵育两种方式，其中40 ℃孵育因为短时高效而得到更广泛的关注。郭秀瑾等在酶添加量10 U/g、反应温度40 ℃条件下研究不同MP凝胶化时间对DCL的影响，发现前4 h内MHC含量逐渐下降且MP凝胶的微观结构越来越规则和致密，证明随着反应时间的延长，DCL逐渐增加。不同TGase催化时间形成的不同DCL的MP凝胶微观结构如图3所示。

  溶液离子强度的变化会改变环境的pH值，研究之后发现在25 ℃、100 U/g条件下，TGase催化的MP凝胶在酸性环境中强度较低，在弱碱性环境中强度相比来说较高，pH 8.5时凝胶强度最大。同时，因MP具有盐溶特性，高盐离子浓度能够促使MP结构展开，增加TGase对谷氨酰胺和赖氨酸残基的可及性，提高DCL。此外，研究之后发现Ca2+具有激活TGase的作用，能够增加DCL，使MP凝胶品质增强，微观结构紧密、均匀，空洞孔洞少；但是过高的Ca2+含量则会导致过度交联，导致MP凝胶强度、弹性下降。

  在过去的研究和实际生产中，许多外源添加物已被开发并用于MP改性，包括多酚、碱性氨基酸、亲水胶体、淀粉和非肉蛋白等。但由于大多数的外源添加物都是通过非共价相互作用修饰MP结构以改善其凝胶特性，作用相对有限且不稳定，因此近年来研究者们开始关注外源添加物与TGase的协同作用。本节对这些不同外源添加物与TGase协同催化MP交联的效果及其分子作用机制综述如下。

  多酚是一类从植物中提取的天然小分子化合物，具有很强的自由基清除能力和抗氧化活性，因此通常作为功能性食品添加剂应用到肉制品中。多酚具有特殊的结构和特性，能够与MP发生可逆或不可逆的相互作用，并以剂量依赖的方式诱导MP聚集，从而改变MP的氨基酸侧链基团、功能和形态性质。较低浓度的多酚能有效提升MP的交联程度，而高浓度的多酚会由于“氨基-醌”“巯基-醌”等相互作用发生过度交联，破坏MP的二、三级结构，导致MP聚集不均匀，形成较差的三维凝胶网络，凝胶强度降低。TGase催化MP发生共价交联的特性可以很好地弥补多酚的劣势，因此有研究者将二者复配应用于MP体系中，研究其协同作用对DCL和MP凝胶特性的影响。

  Chang Jinyang等研究了TGase与绿原酸（CA）协同改善氧化MP凝胶特性的效果，其根据结果得出高浓度CA会导致MP凝胶的网络结构松散、孔径大且不规则，而在TGase与CA协同作用下MP凝胶网络结构紧凑、孔隙均匀，这说明TGase能够克服高剂量CA引起的凝胶结构劣变，增加DCL。同时，二者的协同作用使更多的水分子被截留在凝胶内部，并使水分分布趋于均匀，明显提高氧化损伤MP凝胶的持水能力。同时，有研究者通过分子对接说明了表没食子茶素没食子酸酯（EGCG）与MHC的共价和非共价相互作用，确认了以MHC为底物的TGase催化机制（图4）。

  碱性氨基酸是人体的必需或半必需氨基酸，包括精氨酸（Arg）、赖氨酸（Lys）和组氨酸（His），作为一种安全无毒、来源广泛、营养健康且价格低的小分子物质，将其添加到食品体系中不会引入有害于人体健康的物质，是一种绿色的食品添加剂。大量研究表明，在MP溶液中添加碱性氨基酸可提升体系pH值，并通过电荷作用扰乱MP分子结构，使肌球蛋白丝状体解离，进而使MP溶解度增加。另外也有研究者发现碱性氨基酸能够最终靠与MP中酸性氨基酸残基发生相互作用抑制MP聚集，起到增加MP溶解度的效果。溶解度的增加会使得MP结构展开，不仅有利于形成良好的三维网络结构，还能增加TGase对赖氨酸和谷氨酰胺残基的可及性，增加DCL并改善MP凝胶特性。

  Cao Yungang等研究之后发现与单独添加TGase或Lys的实验组相比，二者协同作用的MP凝胶呈现出更为精细、光滑、致密的网络结构，说明TGase与Lys在提升DCL和改善凝胶结构方面具有协同作用。此外，Lys的ε-氨基作为TGase的反应底物，使得Lys可以在TGase的作用下被连接到MP分子内部，因其本身就具有咸味，可以轻松又有效地提升产品的风味特征和营养价值。Shi Tong等进一步研究在微波辐射条件下，Arg与TGase协同改善低盐MP凝胶特性的分子作用机制，发现Arg能够结合在MP表面，并通过静电作用和阳离子相互作用增加MP的水分散性，使其在TGase作用下发生更大程度的交联，其交联机制如图5所示。同时，在TGase作用下相互靠近的MHC能与Arg的羧基产生相互作用破坏掉原有的氢键，产生新的氢键，使MP分子出现更多的展开和聚集行为，明显提高热诱导凝胶的DCL，进而提升凝胶强度和保水性。

  亲水胶体是以单糖为单位形成的大分子多糖，在自然界中来源丰富，因拥有非常良好的增稠、胶凝、稳定、保水以及乳化能力，在饮食业中快速地发展并得到普遍应用。肉制品工艺流程中常用的亲水胶体包括魔芋胶、卡拉胶、可得然胶、黄原胶、海藻酸钠和纳米纤维素等，溶于水后能够与水分子相互作用形成水凝胶，在MP体系中形成较稳定的蛋白质-多糖-水复合体系，对于致密稳定的MP凝胶形成有推动作用。基于过去几年的突出成果和快速进展，目前关于亲水胶体的研究正转向与其他成分相互作用的调控。

  孙乐常等研究在热诱导凝胶形成过程中添加TGase和魔芋胶（KGM）对MP凝胶品质的影响，根据结果得出KGM的加入引起了MP周围水分子的重排，改变了MP的分子间作用力，因此导致MP中亲水性氨基酸暴露，为TGase催化ε-(γ-谷氨酰胺)赖氨酸键的形成提供了有利条件，增加了DCL。但是，Zhang Xiaowei等研究之后发现羧化纳米纤维素（cNFC）和TGase能够协同提升MP凝胶的质构特性，但并未增加DCL。其作用机制如图6所示，TGase催化MP交联，抑制cNFC的运动，形成MP-cNFC半互穿网络结构，其中两种物质几乎不发生相互作用而是保持各自的结构，相互纠缠、相互支撑，来提升MP的凝胶强度。

  淀粉作为一种水固结剂，在许多肉制品生产的全部过程中起到了减少相关成本、提高保水性、改善质构特性的及其重要的作用。虽然MP和淀粉在加热过程中的热转变是相互独立的，但淀粉在加热温度达到70 ℃时发生糊化，淀粉颗粒吸收大量的水，体积膨胀到初始大小的数倍，能够对MP凝胶的网络结构起到支撑作用，使其具有更加好的持水力和更高的凝胶强度。

  夏秀芳、邓思杨等研究不同的马铃薯淀粉和TGase添加量对MP热诱导凝胶特性的影响，发现马铃薯淀粉与TGase的添加能够促使MP在分子内和分子间产生交联，形成大分子物质。但二者作用机制不同且没有观察到协同作用。淀粉糊化吸水后与MP相互作用形成淀粉-蛋白-水的复合型网络结构，提升了MP凝胶的持水性和凝胶强度，主要涉及氢键等非共价作用；而TGase是通过催化作用形成ε-(γ-谷氨酰胺)赖氨酸键，使MP凝胶网络更为致密，共价作用是此过程中的重要的因素。此外，有研究者发现添加过量的淀粉会导致DCL降低，其原因可能是在加热升温的过程中，淀粉糊化的发生先于MP凝胶的形成，过量的淀粉颗粒遮蔽了赖氨酸和谷氨酰胺残基，降低了TGase对底物的可及性，进而导致DCL降低。

  在肉制品加工中，添加植物蛋白能够在保证产品质量的前提下减少相关成本，提高经济效益。这是因为植物蛋白本身能通过填补凝胶空隙或者改变凝胶结构而影响MP热诱导凝胶特性。然而，由于缺乏结构变化，植物蛋白和MP分子之间的相互作用通常有限，甚至可能由于干扰MP凝胶行为而对凝胶品质产生负面影响。

  Jiang Jiang等研究改性的大豆分离蛋白（SPI）与TGase协同作用对DCL和MP凝胶特性的影响，发现酸改性的SPI能够明显提升MP的最终G′值，且TGase的加入进一步强化了上述现象，说明TGase与酸改性的SPI在增加DCL方面有明显的协同作用。推测其原因，一方面是SPI增大了MP的溶解度，增强了TGase对底物氨基酸残基的可及性；另一方面是TGase能催化SPI中的β-伴大豆球蛋白（7S）和球蛋白（11S）与MP中活性基团发生共价交联。同时，有研究者发现超声改性的豌豆分离蛋白（PPI）和TGase对于改善低磷环境下MP的凝胶特性具有相似的协同效应，能使焦磷酸钠（SPP）的添加量减少50%，其作用机制如图7所示。

  随着人们对高品质食品需求的增长，超声处理（UT）、高压处理（HPP）、微波和脉冲电场等一系列新型加工技术正在食品工业中推广应用，由于其具有独特的能量传输机制，生产效率更高、产品品质更好、对环境的影响更小，因此近年来研究者针对上述新型加工技术开展了大量研究。

  UT是一项新兴的非热加工技术，因其无污染、安全、易操作等优点在食品加工领域得到了广泛的研究，具有很大的应用潜力。超声波能够产生机械效应、热效应和空化效应，其中空化效应对MP结构的影响最为显著。空化效应即超声产生的气泡在爆破时引起微射流对物体表面造成物理损伤的现象，能够破坏肌纤维的Z线和M线，增大肌纤维间的间隙，进而增强蛋白质-水相互作用，同时使蛋白质的活性基团暴露，有利于蛋白质-蛋白质相互作用，有助于形成均匀致密的三维网络结构。近年来，超声辅助酶技术被广泛应用于改变食物蛋白质的结构和性质。

  Gao Xia等研究发现，超声产生的空化效应会释放大量的能量并产生强烈的剪切力，导致蛋白质构象变化，肌动球蛋白解离，使肌球蛋白在盐溶液中的溶解度升高，并随着反应进行均匀分散，充分暴露出供TGase作用的活性基团，在其热诱导凝胶中形成更多的ε-(γ-谷氨酰胺)赖氨酸键，其作用机制如图8a所示。此外，还有研究者推测UT改变了TGase的构象，提高了TGase活性，并诱导了更适合TGase作用的MP构象，使DCL进一步增加。但也有研究表明，过强的超声强度可能会导致TGase结构大幅改变，丧失其原有活性。

  HPP是一项高效率、低能耗、无毒无害的非热处理技术，因其对菌落致死率高达97%，能够有效延长产品的货架期，已作为一种冷杀菌手段在食品行业中得到了广泛应用。近年来，研究者又发现HPP能够改变蛋白质结构，暴露出巯基和疏水基团，减少蛋白与水分子的接触，有利于蛋白质-蛋白质相互作用。同时，HPP还会影响蛋白质侧链的相互作用，进而引起蛋白质变性、聚集或凝胶化，但其形成的凝胶结构类似于一种“海绵状”，主要由疏水作用力维持，无法形成均匀稳定的凝胶结构。因此，近年来研究者尝试利用TGase弥补HPP诱导凝胶的不足。

  Herranz等研究TGase、HPP和这两种处理的组合在MP凝胶形成过程中的作用，其结果表明，仅添加TGase的处理组形成的凝胶共价键比例较大，凝胶结构具有很强的刚性特征，而HPP处理产生的压缩-膨胀效应会使得非共价键重新组合，产生更富有弹性的凝胶网络，二者的联合作用没有观察到明显的协同效果。但Kunnath等研究发现TGase对HPP诱导的MP凝胶特性具有明显的提升效果，具体表现为TGase的加入使HPP诱导的MP凝胶网状结构呈现出更为连续、均匀的状态，在后续加热过程中，相互靠近的巯基形成二硫键进一步加强了MP聚集，形成表面连续均匀、孔洞小的凝胶，具有更强的凝胶强度。

  上述研究结果并不一致，这可能与HPP作用的强度、时间等因素有关，但更重要的似乎是HPP与TGase的作用顺序。如图8b所示，先加入TGase反应一段时间后再进行HPP，则HPP作用效果不显著，这是因为TGase催化产生的共价键强于HPP建立的非共价相互作用。先进行HPP可以促进MP的展开，使更多活性基团暴露，更容易被TGase催化形成共价键。

  与传统加热相比，微波处理是一种绿色、环保、清洁的技术，它通过产生电磁场进行加热，直接引起材料分子内的振动，由于其穿透能力强、加热速度快、加工时间短、能源效率高、操作简单，在食品工业中得到了广泛应用，包括烹饪、杀菌、干燥、解冻、生物活性成分提取和诱导MP凝胶化等。微波因其特殊的交变电场，可以改变蛋白质分子内部的电荷环境和内电场分布，从而破坏蛋白质肽链之间的静电作用，和传统的水浴加热相比更容易形成肌球蛋白聚集体从而形成更好的凝胶结构。

  然而，Cao Hongwei等研究相同的TGase反应条件下，微波加热与传统水浴加热对MP凝胶特性的影响，结果表明两种加热方式诱导的MP凝胶的DCL差异不大。这是因为微波所产生的交变电场对MP分子有“撕扯”的作用，有利于MP结构展开，原本包埋在其内部的活性残基暴露，使得二硫键广泛形成，但二硫键所产生的空间位阻会阻碍ε-(γ-谷氨酰胺)赖氨酸键的形成，且随着时间的延长，二硫键作用形成的大分子聚集体又会将原本暴露出来的活性残基重新包埋起来，降低TGase对底物的可及性，进一步阻止TGase催化MP交联。其潜在的机制如图8c所示。

  但值得注意的是，微波除了简单的热效应外，还能够最终靠非热效应对酶本身直接产生作用，如酶分子的结构和构象变化，引起酶活性的变化，最终影响其作用结果。研究之后发现TGase的活性受微波功率和加热时间的影响。在相同的升温速率下，微波加热的TGase活性在40 ℃时达到最高值，且高于常规水浴加热，是因为TGase分子自身的介电特性使其在微波交变电场的作用下发生偶极-偶极相互作用，活性位点发生改变而使酶活性提高。因此，将微波改性的TGase加入到MP体系中或许是提高DCL的一种有效手段。

  如今消费者的健康意识逐渐增强，清洁标签食品的发展成为必然趋势，低盐低磷等肉制品的开发生产慢慢的变成了肉品行业的热点研究问题。TGase能够催化生成ε-(γ-谷氨酰胺)赖氨酸键，提高DCL，赋予MP良好的凝胶特性，进而改善肉制品品质，这对于清洁标签肉制品的生产具备极其重大意义。由于TGase单独作用对MP凝胶特性的提升效果有限，因此研究者将其他外源添加物和新型加工技术引入到TGase催化MP共价交联的过程中，旨在弥补TGase作用缺陷的同时逐步提升MP凝胶特性，以获得品质更优的产品。

  近几年，关于TGase与外源添加物或新型加工技术协同改善MP凝胶特性的研究已经取得了一定成果，然而不可忽视的是这些方案还存在着一些问题。第一，虽然目前国内外已有大量研究表明外源添加物如多酚、碱性氨基酸、淀粉、亲水胶体和非肉蛋白等能够与TGase协同提高MP交联程度，但对二者协同作用机制研究的深度和广度还有不足，未来可深入探究其分子互作行为和凝胶过程中MP结构的演化规律。第二，各种新型加工技术与TGase联合作用时的参数选择还不明确，强度过低作用效果不明显，强度过高可能破坏TGase的结构使其失活或对MP结构造成损伤，此外新型加工技术与TGase的作用顺序也是未来研究的一项重点。第三，现有研究大多集中在MP体系中，但对于实际生产中面临的多组分共混体系的研究还不够丰富，因此在未来的研究中，应当考虑TGase的共价交联作用对多组分体系凝胶结构的影响，扩大TGase在食品领域中的应用。第四，研究TGase与外源添加物或新型加工技术协同作用改善凝胶结构对肉制品口感、风味释放和消化吸收等特性的影响，以便合理控制TGase催化的MP-DCL，为实际生产奠定理论基础。

  博士生导师，黑龙江省杰出青年基金获得者、黑龙江省“龙江学者青年学者”、黑龙江省肉类加工与品质控制重点实验室主任、黑龙江省肉品加工与质量控制工程技术研究中心主任、中国畜产品加工研究会理事、中国畜产品加工研究会第一届青年工作委员会委员。曾经获得黑龙江省青年科技奖、哈尔滨市青年科技奖。主要是做肉类加工与质量控制等方面的科研与教学工作。先后主持国家自然科学基金、教育部博士点基金、黑龙江省基金、中央支持地方专项等科研课题20余项。第一或通讯作者发表SCI论文80余篇；获得各类科技奖励16 项，其中第一完成人获得黑龙江省科技二等奖1 项，第二完成人获得黑龙江省科技一等奖2 项；授权国家发明专利17 件，授权国际专利6件，授权国家实用新型专利30余件。

  本文《谷氨酰胺转氨酶催化交联对肌原纤维蛋白凝胶特性影响的研究进展》来源于《食品科学》2024年45卷5期293-302页. 作者：张靖铭，冯旸旸，时平茹，孔保华，曹传爱，王 辉，刘骞. DOI:10.7506/spkx0410-080. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

  实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

  为了帮助食品及生物学科科学技术人员掌握英文科技论文的撰写技巧、提高SCI期刊收录的命中率，综合提升我国食品及生物学科科学技术人员的高质量科技论文写作能力。《食品科学》编辑部拟定于2024年8月1—2日在武汉举办“第11届食品与生物学科高水平SCI论文撰写与投稿技巧研修班”，为期两天。

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