一作解读丨中南大学湘雅三医院: III型前列腺炎也与细菌感染有关吗?(国人佳作)

  传统CP分型中II型和III型应该只是患者EPS中致病菌的丰度不同，均与细菌感染有关。病原微生物的次生代谢产物可能是导致CP患者尤其是III型前列腺炎患者临床药物治疗效果欠佳，病程迁延不愈的原因之一。

  通过检测慢性前列腺炎(Chronic prostatitis, CP)患者(含II型和III型)和健康人群前列腺按摩液(Expressed prostatic secretion, EPS)中微生物的组成和功能，探究III型前列腺炎是否与细菌感染有关。根据纳入及排除标准，将57名受试者纳入研究，按患病情况将受试者分为健康组、II型前列腺炎组和III型前列腺炎组。运用16S rRNA测序技术检验测试并分析各组EPS中的微生物组成，运用宏基因测序技术进一步探究III型前列腺炎组中差异菌的功能。采用生物信息学软件进行数据分析，以P0.05具有统计学意义。根据结果得出，CP患者和健康人群的EPS中均存在大量的微生物。但是，与健康对照组相比，CP患者(包括II型和III型) EPS中Pseudomonas(假单胞菌)、Haemophilus(嗜血杆菌)、Sneathia(纤毛菌属)、Allobaculum(粪异杆菌)和Enterococcus(肠球菌)的相对丰度具有非常明显差异，只是II型CP患者差异菌的相对丰度远高于III型，且针对III型前列腺炎组的宏基因测序结果为差异菌具备一定的生物学功能。综上所述，III型前列腺炎患者的EPS中含有与II型前列腺炎患者相同类型且具备生物学功能的差异菌，但相对丰度低，未达到体外细菌培养的最低阈值。III型前列腺炎可能也是细菌感染所致。

  根据纳入、排除和NIH分类标准，CP患者中15例被纳入II型前列腺炎组，29例被纳入III型前列腺炎组，健康者13例被纳入对照组。所有受试者的基本特征无显著差异(表1)，组间匹配相似。然后在男性泌尿科医生的指导下，收集受试者填写的NIH-CPSI、GAD-7和PHQ-9量表。通过对量表结果的分析，发现CP患者的疼痛症状、下尿路症状和生活品质明显差于健康人群。同时，与健康人群相比，任何类型CP患者都伴有某些特定的程度的精神和心理障碍。

  57个样本的数据共获得4408023个可读片段。对所有有效序列进行聚类/去噪后，得到19599个操作分类单元(OTU)。根据样本中特有或共有的OTU，我们绘制了维恩图，直观地显示了各组样本在OTU水平上的成分相似性和重叠(图1C)。同时，使用R语言mixOmics包对丰度大于10的所有OTU做多元化的分析(图1B)。从维恩图和PLS-DA分析坐标图中显而易见，不一样CP患者和健康对照的EPS中均存在较多的微生物，它们在数量和结构上都有自己的特点，在组间也有一些差异。

  图中显示了属水平上最具优势的20个属，其余丰度相比来说较低的属分类为图中所示的Other；(B) PLS-DA坐标图。每个点代表一个样本，颜色相同的点属于同一组，同一组的点用椭圆标记；(C)基于OTU的维恩图，显示不同组之间共有或特有的OUT数。(D) Alpha多样性指数稀释曲线

  分类注释分析将代表性OTU序列与Greengenes数据库进行比对，得到物种注释信息。本研究共注释了36门100纲165目237科432属274种。图1A为属水平上不同组中相对丰度前20位的菌属相对分布情况。

  热图分析为了研究样本和分组之间的相似性或差异性，从分类信息和样本之间的差异性两个方面做水平聚类，寻找物种或样本的聚集规律。在门、纲、目、科、属和种水平上对所有样本做热图聚类分析(图2A)。根据16S rRNA基因测序结果，属水平前5位细菌属依次为链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、弧菌属(Vibrio)、Campylobacter和Faecalibacterium。

  纵列是样本名称信息。横行是属水平分类的注释名称。图上方的聚类树是所有样本物种丰度分布的相似聚类。左边的聚类树是样本物种丰度分布的相似聚类。中间为log10(绝对丰度)的热图；(B) LEfSe分析的进化分支图(LDA2)。从内到外，进化分支图对应着科、属的不同分类水平，分类水平之间的联系代表着归属关系。每个圆节点代表一个物种。黄色节点表示组间无显著差异，非黄色表示该物种是对应颜色组的特征微生物(在该组丰度明显更高)。

  基于样本的稀疏分析通过α多样性评估样品的微生物多样性。不同α多样性指数的稀疏曲线表明，测序深度已经覆盖了样本中所有的物种(图1D)。本研究通过observed features、Chao、Faiths系统发育多样性、Shannon和Simpson指数来描述微生物多样性。在获得总体α多样性指数后，结合分组信息，采用Wilcox检验比较组间显著性差异。结果显示，II型前列腺炎组与健康对照组的菌群Shannon(图3A)和Simpson指数(图3B)存在非常明显差异。采用β多样性分析评估样本间微生物群落结构的差异。Bray-Curtis获得完整的β多样性指数后，采用PERMANOVA方法比较各组间微生物群落结构，β多样性PCoA图(图3C-E)和NMDC图也显示各组之间有显著差异(表2)。

  热图分析为了进一步研究CP患者EPS中微生物的功能，根据16S rRNA基因测序分析结果，在III型前列腺炎组和健康对照组中选取具有代表性微生物的10个样本，进行宏基因组测序，并将宏基因组测序数据在KEGG数据库中进行注释。对相关结果进行热图聚类分析(图5A、B)。根据宏基因组测序结果，KEGG涉及的前5条通路分别是核糖体(map03010)、D丙氨酸代谢(map00473)、细胞周期Caulobacter (map04112)、氨基酰tRNA生物合成(map00970)和氨基酸生物合成(map01230)。前5种KOs分别为K01990、K02358、K02874、K01992和K02909。

  功能相对丰度差异分析采用非参数检验和线性判别分析相结合的LEfSe方法分析各组的生物标志物。在通路水平上，鉴定出两条KEGG通路，这两条通路在III型前列腺炎组中有显著差异(LDA2，P 0.05；图6B)。其中，各种次生代谢物生物合成下Aurachin生物合成途径(map00999)的差异最为显著，该途径还聚集了重要的KO：K02078(LDA 4，P 0.05；图5C，D)。根据KO groups之间的LEfSe差异，我们进一步对通路图进行了着色，标记各组检测到的基因和基因生物标志物，发现acpP基因在III型前列腺炎样本中显著表达(图6A)。

  采用16S rRNA及宏基因组测序技术检测分析II型、III型前列腺炎患者及健康人群EPS中微生物组成，探讨差异菌在III型前列腺炎中的作用。结果显示，健康人群及II型、III型前列腺炎患者的EPS中普遍存在微生物。与健康人群相比，II型和III型前列腺炎患者EPS中存在相同类型的差异菌。与健康人群相比，II型前列腺炎患者EPS中微生物α和β多样性均存在非常明显差异。与健康人群相比，III型前列腺炎患者EPS中微生物α和β多样性无显著差异。II型和III型前列腺炎患者EPS中微生物种类较健康人群相比，大部分差异菌种类重叠，但II型的相对丰度远高于III型。同时，宏基因组测序结果显示，差异菌具有一定的功能。因此，作者推测III型前列腺炎也可能是由致病菌感染引起的，III型前列腺炎患者体外细菌培养无法从其EPS中检出致病菌，可能是致病菌丰度过低，达不到检出阈值。 微生物在II型、III型前列腺炎患者和健康人群的EPS中普遍检测到(图1A-C)，这与以往研究者认为微生物在人体器官中都会存在的看法一致。人体的正常器官并不是完全无菌的，而是存在许多微生物，它们有独特的菌群结构和局部微生态，当菌群失调时可能导致某些疾病。有研究报道，从正常前列腺组织、前列腺癌组织和CP患者的EPS样本中均分离出细菌。 与健康人群相比，II型前列腺炎患者α和β多样性有显著差异(见图3A-E;表2)，通过体外细菌培养，与II型前列腺炎EPS病原菌的临床特征相符。除II型前列腺炎外，III型前列腺炎患者EPS中Pseudomonas、Haemophilus、Sneathia、Allobaculum和Enterococcus的相对丰度也显著高于健康受试者(图4C)。而Pseudomonas的相对丰度远低于II型前列腺炎患者(图4A)。作者推测，III型前列腺炎患者体外细菌培养未检出致病菌，可能是由于其EPS中不同细菌的绝对丰度未达到体外培养的最低阈值。 此外，对典型III型前列腺炎样本进行宏基因组分析，探讨差异菌的功能。KEGG功能分析显示，阿特拉津降解(map00791)和Aurachin生物合成(map00999)两条代谢途径存在非常明显差异(LDA 2；图6B)。同时，Aurachin生物合成(map00999)代谢途径acpP(酰基载体蛋白P)基因在III型前列腺炎组中显著表达(图6A)。已证实acpP基因是Pseudomonas aeruginosa和Baumannii等条件致病菌细胞壁合成的必需基因。有必要注意一下的是，许多生物工程研究的重点是降低acpP基因的水平。从本研究的16S rRNA测序结果能够准确的看出，Pseudomonas是II型和III型前列腺炎与健康对照相比差异最显著的菌群(图4B，C)。因此，作者觉得acpP基因在III型前列腺炎中的高表达可能由条件致病菌Pseudomonas引起。Pseudomonas是临床常见的条件致病菌，具有致病性低、耐药强的特点，广泛分布于正常皮肤、肠道和泌尿生殖道。acpP基因作为Aurachin生物合成途径的关键调控基因之一，参与微生物次生代谢物的产生。在Aurachin生物合成途径中，产物Aurachin D及相关生物合成物Aurachin RE和Aurachin SS抗菌效果最佳。 当机体脆弱时，条件致病菌产生次级代谢产物抗生素，与其他正常或有益菌竞争生存空间和资源，最终发展成为局部微生态的优势菌，导致疾病的临床表现。对于CP患者，当条件致病菌发展为优势菌株且其绝对丰度高于一般体外细菌培养所需的阈值时，患者被诊断为II型前列腺炎，低于阈值时(隐性感染)被诊断为III型前列腺炎。同时，由于CP患者局部微生态长期受到低浓度抗生素(不同细菌代谢物)的刺激，产生某些特定的程度的耐药，目前药物医治的临床疗效不佳。 本研究存在一些有必要注意一下的局限性。首先，由于检测成本等因素的限制，临床样本量较小，需要在未来的研究中进行更大的队列研究。其次，本研究的结论仅基于16S rRNA、宏基因组测序及相关研究结果。因此，这些结果要进一步的基础实验来验证。当然，上述不足也是我们后续研究的内容。

  CP患者和健康人群的EPS中均存在大量的病原微生物。Pseudomonas(假单胞菌)、Haemophilus(嗜血杆菌)、Sneathia(纤毛菌属)、Allobaculum(粪异杆菌)和Enterococcus(肠球菌)是同时存在于II型和III型前列腺炎患者EPS中的差异菌。功能检测分析表明它们有可能正是导致CP患者出现前列腺炎症状的罪魁祸首。传统CP分型中II型和III型应该只是患者EPS中致病菌的丰度不同，均与细菌感染有关。病原微生物的次生代谢产物可能是导致CP患者尤其是III型前列腺炎患者临床药物治疗效果欠佳，病程迁延不愈的原因之一。