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浙科大:综合转录组和代谢组分析为浙麦冬皂苷生物合成的机制及其在缓解镉诱导的氧化损伤中的作用提供见解

【概要描述】

浙科大:综合转录组和代谢组分析为浙麦冬皂苷生物合成的机制及其在缓解镉诱导的氧化损伤中的作用提供见解

【概要描述】浙科大:综合转录组和代谢组分析为浙麦冬皂苷生物合成的机制及其在缓解镉诱导的氧化损伤中的作用提供见解

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  浙麦冬(沿阶草)(Ophiopogon japonicus)是我国著名的富含皂苷类成分的传统中草药。本研究以浙麦冬为材料,在Cd胁迫下,探讨浙麦冬皂苷的生物合成机制及其在缓解Cd诱导氧化损伤中的作用。在Cd污染土壤处理中,浙麦冬总皂苷含量是对照组的1.68倍,Cd-2(Cd浓度为0.61mg/kg)和Cd-3(Cd浓度为1.23mg/kg)处理的皂苷含量约为Cd-CK(Cd浓度为0.14mg/kg)处理的2倍,这些根据结果得出Cd胁迫导致了浙麦冬总皂苷的积累。代谢组学分析鉴定了浙麦冬积累的总皂苷,主要为单萜、二萜和三萜。浙麦冬积累的皂苷具有抗氧化能力,能防止Cd诱导的活性氧(ROS)积累。皂苷在促进超氧化物歧化酶(SOD)活性和减少ROS积累方面起着至关重要的作用。转录组分析揭示了Cd胁迫下浙麦冬皂苷合成的关键基因,包括SE、2个SS和6个cyp450,这些基因表达量与皂苷代谢途径中的差异表达代谢物(DEM)水平呈正相关。此外,转录因子调控网络表明bHLH1、bHLH3、mTERF和AUX/IAA转录因子是参与皂苷合成基因的关键调控因子。这些发现有助于我们进一步了解Cd胁迫下浙麦冬皂苷合成调控网络及其在缓解氧化损伤中的作用。

  译名:综合转录组和代谢组分析为浙麦冬皂苷生物合成机制及其在缓解镉诱导的氧化损伤中的作用提供了见解

  为探究Cd对浙麦冬总皂苷含量的影响,我们测定了两组Cd胁迫处理下的总皂苷含量,即污染土壤和对照处理(第1组)、4个不同浓度梯度Cd处理(第2组)(试验一) (表1)。Cd污染土壤处理90d后,根中总皂苷含量是对照的1.68倍。不同浓度梯度的Cd处理增加了根中皂苷的水平。Cd-2和Cd-3处理的总皂苷含量约为Cd-CK处理的2倍。我们还进行了浙麦冬Cd胁迫水培处理( Cd-0(Cd浓度为0 mg/L),Cd-M(Cd浓度为1mg/L)和Cd-H(Cd浓度为10 mg/L))以评估根部总皂苷含量(试验二)。我们在根部均可观察到Cd2+荧光,且Cd-H的荧光强度高于Cd-M (图1A和B)。与土培中观察到的表型相似,在Cd胁迫下,水培处理明显地增加了浙麦冬的皂苷含量(图1C)。这些根据结果得出,Cd胁迫可能会引起浙麦冬根部皂苷积累。

  图1 Cd胁迫对根中皂苷含量的影响。(A) 铅离子/镉离子绿色荧光探针检测根中Cd2+的丰度。(B)不同Cd处理下根系中Cd2+含量的相对荧光强度。Image J软件估算Cd2+荧光相对强度。(C)Cd胁迫对总皂苷含量的影响。误差棒代表不同生物学重复(n≥3)的平均值±标准差(SD)。相同字母表示在p<0.05时无显著差异。

  GO功能富集分析显示,在Cd-H vs Cd-0 和 Cd-M vs Cd-0中,氧化还原酶活性是最显著的term(图2A)。我们进一步检测了不同Cd胁迫下浙麦冬的ROS水平和抗氧化酶活性,结果显示,根和叶中的H2O2、O2·-和MDA含量在Cd胁迫下均非常明显升高(图2B)。根中的ROS水平明显低于叶片。通过ROS荧光和硝基蓝四唑(NBT)原位染色证实,Cd胁迫明显提高了浙麦冬总ROS水平,导致氧化损伤(图2C)。不同抗氧化酶的检测表明,浙麦冬根和叶中不同的酶对Cd胁迫的响应不同(图2E)。POD和APX酶活性在不同Cd处理下相对来说比较稳定。在Cd-H处理下,叶片中CAT活性升高,而根系中CAT活性则随Cd含量的增加先升高后降低。Cd胁迫明显提高了根系中SOD活性,降低了叶片中的SOD活性。这些根据结果得出,可能是由于Cd诱导的皂苷和SOD活性的增加,使得浙麦冬根中的ROS水平明显低于叶中的ROS水平。

  图2 Cd胁迫对浙麦冬叶片和根系活性氧(ROS)水平和抗氧化酶活性的影响。(A)转录组学对Cd-H vs Cd-0 和 Cd-M vs Cd-0的GO富集分析。(B)不同Cd处理,浙麦冬叶片和根中H2O2、O2·-和MDA含量的差异。(C) 基于二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)染色的总ROS分布。合并后的图像显示了DCFH-DA信号(绿色荧光)和亮场的重叠。(D)用NBT对浙麦冬叶片和根中O2·-生成进行组织化学定位。(E)Cd胁迫对浙麦冬叶片和根抗氧化酶活性的影响

  我们利用外源皂苷对离体叶片进行培养,以测试皂苷有没有清除Cd胁迫下积累的ROS功能(试验Ⅲ)。在高浓度Cd胁迫(Cd-1000)处理3天后,离体培养的叶片呈现轻微的黄化表型(图3);离体叶片中ROS水平非常明显升高,并与Cd浓度表现出较强的相关性(图3B)。皂苷培养明显降低了Cd-10和Cd-100处理下离体叶片中H2O2、O2·-和MDA含量(图3B)。在Cd-1000处理下,皂苷培养略微降低了离体叶片中O2·-和MDA含量,但未达到显著水平。NBT染色观察结果与实验中化学分析结果一致(图3C)。我们还研究了不同Cd胁迫处理下不同抗氧化酶对皂苷的响应,外源皂苷处理明显提高了Cd-0、Cd-10和Cd-100处理下离体叶片中的SOD活性(图4A)。经外源皂苷培养后,APX、CAT和POD抗氧化活性存在非常明显差异。相关系数分析显示,皂苷含量与SOD活性之间呈弱相关(r=0.29),但在统计学上呈正相关(图4B)。我们研究了不同处理时间下皂苷对SOD活性的影响,与未处理的对照组相比,施用皂苷12、24、48和72 h后,SOD活性也非常明显升高(图4C)。这些根据结果得出,施用皂苷可提高离体叶片SOD活性,缓解Cd胁迫诱导的ROS积累。

  图3 不同Cd胁迫处理下皂苷对离体叶片ROS积累的影响。(A)不同浓度外源皂苷对离体叶片O2·-、H2O2和MDA含量的影响。Cd-0、Cd-10、Cd-100和Cd-1000分别代表不同浓度Cd2+处理的离体叶片组,S-0、S-10和S-20分别代表蒸馏水、10 mg/L皂苷和20 mg/L皂苷培养的叶片组。(B)NBT对离体叶片O2·-生成的组织化学定位。

  图4 不同Cd胁迫处理下皂苷对离体叶片抗氧化酶活性的影响。(A)不同浓度外源皂苷对离体叶片SOD、POD、CAT和APX活性的影响。(B)皂苷含量与ROS水平相关的其他变量之间的相关系数,*表示在P<0.05水平上差异有统计学意义。(C)外源皂苷在不同处理时间(0、6、12、24、48和72 h)对离体叶片SOD活性的影响。Cd-0、Cd-10、Cd-100和Cd-1000表示不同Cd2+浓度处理的离体叶片,S-0、S-10和S-20分别代表蒸馏水、10 mg/L皂苷和20 mg/L皂苷培养的叶片。

  我们采用水培法施用外源皂苷,当浙麦冬受Cd胁迫时,外源皂苷明显降低了根系中H2O2、O2·-和MDA含量(图5),而叶片中的ROS水平没有显著影响。我们还研究了皂苷对Cd胁迫下浙麦冬根和叶中SOD活性的影响,浙麦冬根在Cd-0和Cd-10处理下施用皂苷, SOD活性明显提高, 而在Cd-100处理下施用皂苷,浙麦冬根中SOD活性提高,但不显著。不同Cd浓度胁迫条件下,施用皂苷显著提升了叶片中SOD活性;然而,这种影响在统计学上并不显著。这些根据结果得出,虽然皂苷对叶片影响较小,但在促进根系SOD活性和降低Cd诱导的ROS水平方面发挥了至关重要的作用。

  图5 不同浓度外源皂苷对根和叶中O2·-生成、H2O2含量、MDA含量和SOD活性的影响。Cd-0、Cd-10和Cd-100分别代不同浓度Cd2+处理。S-0和S-20表示用0和20 mg/L外源皂苷处理的浙麦冬。

  我们采用LC-MS/MS分析评估了3种不同Cd浓度处理后9份样品中代谢物的变化,共鉴定出1089种代谢物(图6A)。黄酮类代谢物占所有代谢物的10.1%,而萜类代谢物占5.1%。不同Cd浓度处理下浙麦冬的代谢物谱和PCA的综合描述如图6B所示,不同Cd浓度处理在空间上表现出明显的分离。每个处理的三个重复聚类紧密,表明数据的可重复性较好。DEMs的GO富集分析显示,淀粉和蔗糖代谢(Cd-H vs Cd-0)、黄酮和黄酮醇生物合成(Cd-M vs Cd-0)和类黄酮生物合成(Cd-H vs Cd-M)显著富集(图6C)。此外,参与萜类生物合成的DEMs,包括萜类骨架生物合成、单萜生物合成和类胡萝卜素生物合成、二萜生物合成,显示出高富集性。

  我们利用热图分析了不同Cd浓度胁迫处理下植物甾醇、单萜类、三萜类、皂苷、倍半萜、二萜、胡萝卜素和类固醇生物碱的相对含量(图6D)。通过对不同Cd胁迫处理下DEMs相对含量的聚类分析,我们将DEMs分为3类:灰色、黄色和浅绿色。在经Cd-M处理后,灰色组中所有DEM的相对含量均明显地增加。Cd-H处理后,黄色组所有DEM的相对含量均增加,而绿色组所有DEM的相对含量在Cd-M和Cd-H处理后均有不同程度的降低。同时,我们得知在不同Cd胁迫处理下灰色和黄色组中相对含量增加的DEMs主要是单萜、二萜和三萜类(图6D),表明Cd胁迫下皂苷含量的增加可能与这些萜类化合物相对含量的增加有关。

  图6 不同Cd浓度下水培浙麦冬根系代谢组学分析。(A)总差异代谢物(DEMs)的分布。不同色块代表不一样的种类的代谢物。(B)不同Cd处理下根系主成分分析(PCA)。处理包括对照(Cd-0)、1 mg/L Cd(Cd-M)和10 mg/L Cd(Cd-H)。(C)Cd胁迫处理后DEMs的基因本体(GO)富集分析。选择排名前20的term进行展示。(D)不同Cd胁迫处理下所有萜类化合物相对含量的热图分析。同一色块代表每一类代谢物。

  为了研究不同Cd浓度胁迫下浙麦冬皂苷积累的机制,我们检测了三萜皂苷生物合成关键基因的表达模式(图7)。我们鉴定出105个参与编码MVA、MEP和皂苷生物合成途径的基因,包括HMG-CoA合成酶(HMGS)、HMG-CoA还原酶(HMGR)、MVK激酶(MVK)、GPP合成酶(GPS)、MEcPP合成酶(MDS)、HMB-PP合成酶(HDS)、HMB-PP还原酶(HDR)、角鲨烯合酶(SS)、角鲨烯环氧化酶(SE)和细胞色素p450(CYP450)。这些基因的表达模式在对Cd胁迫的响应中存在非常明显差异(图7)。例如,编码HDR和CYP90A1的基因在不同Cd胁迫下表达下调,而编码CYP26A的基因则表达上调。热图聚类分析结果为,在不同Cd浓度胁迫条件下,HMGR的16个基因中,有6个基因 的表达水平明显提高,它们分别是Cluster-13233.0、Cluster-21637.126374、Cluster-21637.122059、Cluster-21637.76899、Cluster-21637.70547、Cluster-21637.69771。SS和SE酶是参与萜类化合物生物合成的关键酶。在Cd胁迫下,3个SS基因和6个SE基因的表达量明显地增加。此外,1个MVK基因、2个GPS基因、3个HDS基因、3个SS基因、9个CYP1A1基因、2个CYP1D基因、5个CYP709基因和7个CYP71A基因的表达水平均显著升高。

  图7 浙麦冬三萜皂苷生物合成途径的初步研究。三萜皂苷生物合成途径中参与每一步顺序催化的编码酶的基因的表达水平。不同的紫色代表不同的Cd胁迫处理。红色和白色分别表示较高和较低的基因表达水平。

  为了进一步挖掘浙麦冬皂苷积累的候选基因,我们对DEMs含量与DEGs表达量进行了相关性分析(图8)。基于DEMs和DEGs之间的相关系数,我们通过聚类分析将相关性热图分为四部分。上调(UP)组表示代谢产物的相对含量随Cd-M或Cd-H胁迫而增加。第四部分的所有DEMs都属于UP组,包括单萜(益母草苷A,反-香苇醇、杜仲醇、香叶基丙酮和梓醇),二萜(千金子二萜醇、蕃红花酸、银杏内酯A、白果内酯、辣椒苷I),三萜(鲁斯可皂苷元、人参皂苷C-K、羟基积雪草苷),倍半萜(花姜酮、蕨素A、野马追内酯B),甾体生物碱(垂茄次碱)和皂苷(重楼皂苷VII)。我们总共发现了21个基因与这些DEMs的数量呈正相关,这在某种程度上预示着这些基因可能与浙麦冬中皂苷含量的积累有关(图8)。例如,相关性热图显示重楼皂苷VII与CYP450高度相关,SE(Cluster-21637.53369)和SS(Cluster-21637.58176)与银杏内酯A、白果内酯、益母草苷A、杜仲醇和香叶基丙酮呈较强的正相关(r0.8)。

  图8 三萜皂苷相关基因与代谢物之间相关系数。不同的色块代表不同的代谢物、类别或群体。蓝色和红色圆圈表示相关系数,蓝色和红色分别代表负相关和正相关。圆圈的大小和强度与相关系数的大小相对应,圆圈越大、越暗表示相关系数越强。

  图9 关键基因与转录因子共表达分析网络。(A)九象限图显示了不同比较下差异表达基因(DEGs)和转录因子(TFs)的关联。(B)DEGs(红色方块)和TFs(黄色圆圈)之间的连接网络。节点大小表明基因表达量的变化。边界的宽度表示与该节点交互的节点数量。边缘颜色表示相关系数。蓝线反映了两个节点之间的相关系数大于0.99。

  在此基础上,我们选取了Cd胁迫处理(Cd-H或Cd-M)下log2FC值大于2的DEGs,包括2个SS基因、1个GPS基因、1个SE基因和5个CYP450基因。此外,我们筛选了与这些差异基因相互作用的转录因子,并确定了Cd处理下排名前三的DEGs,并生成了转录因子-基因调控网络(图10A)。在16个转录因子中,bHLH1和bHLH3与SS2、SE、CYP26A、CYP71A1等几个hub基因的相关系数均大于0.95(红色连线)。此外,bZIP、AUX/IAA或C2H2与CYP1A1的相关系数也超过了0.95(红色连线)。这些转录因子(包括bHLH1,bHLH3,bZIP,AUX/IAA和C2H2)在控制皂苷生物合成基因的表达中起着及其重要的作用。我们随机选取了6对转录因子和差异基因,通过qRT-PCR验证调控网络的可靠性(图10B)。根据结果得出,这些转录因子的表达水平(Pearson相关系数r0.74)和差异基因的表达水平有很强的相关性。其中CYP1A1与bZIP的相关系数为0.985,这些结果证明了转录调控网络的可靠性。

  图10 浙麦冬中三萜皂苷生物合成的转录调控网络。(A)hub基因(红色方块)和转录因子(黄色圆圈)之间的连接网络。红线表明了两个节点之间的相关系数大于0.95。(B)转录因子及其预测靶基因的表达相关性。折线表示转录因子及其相应靶基因的相对表达水平。在Cd-0处理条件下,各种基因和转录因子的表达均以微管蛋白基因进行归一化。每个实验做3个生物学重复。条形图代表来自不同生物学重复的平均值±标准差(SD)。

  皂苷的产生是植物防御系统响应生物胁迫的结果。本文研究了不同浓度Cd胁迫条件下浙麦冬皂苷含量和抗氧化酶活性的影响(表1和图1)。我们的根据结果得出,在2种土培和1种水培的3组Cd处理中,Cd胁迫处理能明显提高浙麦冬根中皂苷的含量,Cd-2和Cd-3处理下浙麦冬根中皂苷含量几乎是Cd-CK处理的2倍(表1和图1)。植物萜类化合物具有共同的前体合成途径,并具有多种复杂结构;代谢组热图分析表明,在不同Cd浓度胁迫处理下,灰色和黄色组中DEMs的相对含量增加,这与皂苷含量的增加有关,主要是单萜、二萜和三萜(图2D)。这些发现与之前对三七的研究非常吻合;特别是植物在低温胁迫下能促进萜类化合物的积累,并使皂苷含量增加2倍。此外,干旱胁迫增加了三七的皂苷含量和体外抗氧化活性。而先前对藜麦的研究表明,在盐胁迫和干旱胁迫下皂苷含量均降低。来自不同植物的皂苷对不同的胁迫表现出不同的响应;最近的研究报道显示,皂苷的水平和分布可能会受到植物所需保护程度的影响。考虑到Cd诱导的皂苷积累,我们大家都认为浙麦冬皂苷的增加可能是其根系抵御Cd胁迫的一种策略。

  皂苷具有抗炎、免疫调节和抗氧化等特性,具有潜在的健康益处。先前的研究报道,Terminalia fagifolia皂苷具有抗癌特性;从番薯块茎中提取的皂苷具有非常明显的抗氧化活性,对健康有益;大豆皂苷能够大大减少DNA断裂,提高膜蛋白活性,以维持适当的含水量。此外,低浓度的皂苷可干预大豆种子萌发,提高大豆抗氧化系统以对抗NaCl诱导的氧化损伤。我们的研究发现,在Cd胁迫下,根中的ROS水平明显低于叶中的ROS水平;这一现象可能与Cd胁迫引起根系中皂苷含量和SOD活性升高有关(图2)。动物和细胞实验研究表明,皂苷具有抗氧化特性,皂苷具有酚类结构,可以清除自由基,防止细胞和组织的氧化损伤。在氧自由基吸收能力实验中,皂树皂苷提取物比卵磷脂表现出更强的自由基清除能力。紫花苜蓿皂苷可能通过抑制仔猪体外细胞MAPK信号通路来预防氧化应激诱导的细胞死亡。因此,我们推测在Cd胁迫下浙麦冬皂苷含量的积累可能表现出抗氧化能力,如SOD活性,以防止Cd诱导的ROS积累。

  前期的一些研究探讨了皂苷在促进氧化还原酶活性和降低ROS水平方面的作用。然而,这些研究大多是利用动物或体外细胞进行的。例如,在一项关于仔猪细胞的体外研究报道中,紫花苜蓿皂苷可能提高抗氧化酶活性,降低MDA含量。大鼠细胞实验研究表明,转录因子AP2能促进人参皂苷成分Rb2激活SOD1;大豆皂苷能提高大鼠肝细胞中SOD和GPX活性,减少ROS积累。研究人员在有关血清的研究中发现,皂苷可提高SOD、CAT和GPX活性,降低MDA水平。在本研究中,在各种Cd胁迫处理下施用外源皂苷可明显降低了ROS水平,并促进了SOD酶的活性(图3-5),这与我们将皂苷施用于整株植物所得到的结果一致(图5)。虽然在整株实验中,外源皂苷对叶片的影响很小,但我们大家都认为这一实验结果是合理的,与浙麦冬在不同浓度Cd胁迫(图2B-E)下根和叶的差异响应是一致的,这种差异可能是由于皂苷倾向于在根中局部积累,使得皂苷在根中的积累较高,而在叶中的积累量较低;另一方面,外源皂苷与非间接接触的组织之间的相互作用可能越来越明显,由此产生实质性的影响,外源皂苷处理离体叶片为这一假设提供了证据。我们的研究根据结果得出皂苷在促进植物SOD活性和减少Cd诱导的ROS积累中起着至关重要的作用。皂苷通过直接作为抗氧化剂和间接通过提高SOD酶活性两种方式降低Cd诱导的ROS积累。

  植物三萜皂苷的生物合成是一个复杂的过程,涉及从乙酰辅酶A到2,3-角鲨烯氧化物的20多个连续的酶促反应。其中,SS和SE在三萜皂苷生物合成中发挥及其重要的作用,SS催化核心类异戊二烯途径中的初始酶促过程,有助于甾醇和三萜的生物合成。SE催化角鲨烯双键氧化生成2,3-氧化角鲨烯,这是植物甾醇和三萜化合物生成的起始氧化步骤。前期对三七的研究表明,Cd胁迫降低了SS活性,SS活性与Cd含量呈显著负相关。在积雪草中,Cd处理下SS基因的表达量比对照增加了3-13倍。在本研究中,转录组分析显示,在Cd胁迫下,3个SS和6个SE基因的表达明显地增加(图7)。DEMs和DEGs的相关性分析表明,SE(Cluster-21637.53369)和SS(Cluster-21637.58176)与代谢产物银杏内酯A、白果内酯、益母草苷A、杜仲醇和香叶基丙酮(r0.8)含量明显地增加呈强正相关(图8)。SS活性和基因表达对Cd胁迫响应的差异可能因物种、Cd胁迫浓度和维持的时间而异。我们的根据结果得出,SE(Cluster-21637.53369)和SS(Cluster-21637.58176)是参与三萜皂苷生物合成的关键基因。这2个基因在Cd胁迫下表达上调与浙麦冬皂苷代谢物含量的增加密切相关。

  前期研究之后发现转录因子bHLH、AP2/ERF、bZIP等在调控植物三萜生物合成中发挥及其重要的作用。在本研究中,我们得知bHLH,bZIP,AP2/ERF-ERF,NAC,C2H2和AUX/IAA在三萜合成的调控中发挥作用,并且这些转录因子的转录水平与SS2,SS1,GPS,SE,CYP26A,CYP71A2,CYP1D,CYP71A1和CYP1A1高度相关(图10)。bHLH家族是最大的转录因子家族之一,在多种生物过程,特别是萜类化合物的生物合成中起着至关重要的作用。bHLH家族中的转录因子MYC2与TPS11和TPS21-合成酶基因的启动子区相互作用,加速倍半萜的合成并促进其表达,从而促进了拟南芥中倍半萜的释放。在长春花中过表达bHLH可能会提高单萜吲哚生物碱的生成。我们的根据结果得出,bHLH1和bHLH3的表达水平与关键基因SS2,SE和CYPF71A1的表达水平呈正相关(r0.95)(图10A)。虽然bHLH在皂苷合成中的具体功能在不同植物之间有几率存在差异,但已经证实bHLH转录因子有助于调控皂苷生物合成途径。此外,bZIP、mTERF、AUX/IAA和C2H2的表达与CYP1A1和SE的表达高度相关(图10)。AUX/IAA作为转录抑制因子,在胁迫反应中发挥及其重要的作用。mTERFs是细胞器基因表达的关键调节因子,对热或盐胁迫等非生物胁迫适应至关重要。因此,我们推测mTERF和AUX/IAA可以响应Cd胁迫,并上调SE和CYP1A1基因的表达,从而使得皂苷在Cd胁迫下的积累。

  Cd胁迫明显地增加了浙麦冬根中的总皂苷含量;代谢组学分析显示,Cd胁迫下浙麦冬根中有多种三萜、二萜和单萜化合物积累。皂苷施用实验证明了其在降低ROS水平方面的及其重要的作用,皂苷不但可以作为抗氧化剂,还可当作提高SOD酶活性的促进剂。转录组分析发现了Cd胁迫下参与皂苷合成的关键基因,包括1个SE、2个SS和6个CYP450基因,这些基因在Cd胁迫下表达上调,并与皂苷代谢途径中的DEM水平呈正相关。转录因子-基因调控网络表明bHLH1、bHLH3、mTERF和AUX/IAA调控了与皂苷合成相关的基因上调。这些发现有助于我们理解镉胁迫下皂苷生物合成的调控网络及其在减轻浙麦冬氧化损伤中的作用,并为分子育种中的基因组改良提供生物学基础。

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